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PCR的基本原理

来源:贝斯特试剂    发布时间:2014-05-06    浏览次数:3577

 

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡聚核苷酸引物。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。
(1)模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解链,使之成为单链DNA,以便与引物结合,为下轮反应作准备。
(2)模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列的3`端配对结合,以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3`-OH。
(3)引物的延伸:DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA 片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期。大多数情况下,平台期的到来是不可避免的,它出现的时间与聚合酶的特性、循环后期酶量或聚合时间不足、dNTP和引物不足等因素有关。