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PCR的基本成分

来源:贝斯特试剂    发布时间:2014-05-06    浏览次数:3274

 

PCR包括7种基本成分:模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。
(1)模板DNA:包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA分子等几乎所有形式的DNA和RNA都能成为PCR技术反应的模板。除此之外,PCR反应还可以直接以细胞为模板。
模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类等。反应体系中浓度一般为100ng DNA模板/100mL反应体系,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
(2)特异性引物:是一段与模板DNA链结合的寡聚核苷酸片段,对于DNA的扩增起到引发的作用。它是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡聚核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
    设计引物应遵循以下原则:
①引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。
②引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3ˊ端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物3ˊ端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性,同时尽可能减少非特异性条带的扩增。
引物量:每条引物的浓度为0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
(3)热稳定DNA聚合酶:目前有两种Taq DNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠杆菌合成的基因工程酶。由于这些聚合酶具有95℃以上的耐热性,在90℃下保温30min仍具有70%酶活性,只需在PCR反应开始时加一次聚合酶,就能在整个PCR循环中保持酶活性,大大简化了PCR操作程序,提高了PCR扩增效力、省时省力,从而使PCR技术得到了进一步完善。目前,催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
(4)脱氧核苷三磷酸(dNTP):是DNA合成的原料,包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris.HCl的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP浓度取决于扩增片段的长度,一般为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低,影响DNA聚合酶的活性。
(5)二价阳离子:常用Mg2+,作为构成热稳定性DNA聚合酶的成分之一。Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度会影响反应中游离的Mg2+浓度。
(6)缓冲液:用于维持反应体系稳定的pH值。一般使用Tris-Cl缓冲液,标准的为10mmol/L,并将其调节到8.3~8.8之间。
(7)一价阳离子:标准PCR缓冲液内包含有50mmol/L的KCl溶液,它对于扩增大于500bp长度的DNA片断是有益的,提高KCl浓度在约70~100mmol/L范围内对改善扩增较短的DNA片断产物是有利的。